Agar payudara dapat memproduksi ASI, payudara membutuhkan satu hormon yaitu Hormon Prolaktin, dibutuhkan untuk memulai, mempertahankan dan melanjutkan produksi ASI.Produksi hormon prolaktin ketika ibu sedang hamil tidak membuat sel-sel ASI dapat memproduksi ASI, karena ditahan oleh hormon progesteron. Setelah melahirkan, progesteron pada ibu menurun, sehingga prolaktin dapat bekerja. Inilah yang membuat produksi ASI meningkat setelah melahirkan.

Prolaktin diproduksi oleh rangsangan sensorik dari puting ketika bayi menyusu pada payudara, rangsangan tersebut dikirim ke otak, untuk kemudian kelenjar pituitari bagian depan pada dasar otak mengeluarkan prolaktin yang masuk menuju payudara agar sel-sel pembuat ASI dapat memproduksi ASI.

Prolaktin akan berada di payudara sekitar 45 menit setelah proses menyusui, sehingga hormon ini menyiapkan produksi ASI untuk menyusui berikutnya, sedangkan untuk penyusuan saat ini bayi mengambil ASI dari persediaan ASI dalam payudara yang disimpan dalam alveoli dan saluran ASI (ductus)

Produksi prolaktin disesuaikan dengan seberapa sering bayi menyusu, bila bayi kurang menyusu maka jumlahnya pun menurun, dan dampaknya payudara menghasilkan ASI lebih sedikit, terutama pada satu sampai dua bulan pertama setelah persalinan, ketika produksi ASI menyesuaikan dengan kebutuhan bayi.

Beberapa hal khusus tentang hormon prolaktin adalah:

1. Hormon prolaktin lebih banyak diproduksi di malam hari; karena itu menyusui terutama di malam hari membantu menjaga pasokan ASI.
2. Prolaktin membuat ibu merasa nyaman, dan kadang mengantuk; karena itu ibu biasanya beristirahat dengan baik meski ia menyusui di malam hari.
3. Prolaktin menekan produksi hormon gonadotrophin atau GnRH, yang dibutuhkan untuk mengeluarkan hormon yang menstimulasi ovulasi. Karena itu menyusui dapat membantu menunda kehamilan baru (KB alamiah).